Von Anfang an war die Sammlung des heutigen Historischen Museums eng mit Gotha verbunden. Seit 1872 sammelten Gothaer Bürger im „Anthropologischen Verein“ das, was ihnen lieb war, um es vor dem Vergessen zu bewahren. Schon seit 1924 ist ihre Sammlung zur Geschichte der Region im Westturm des Schlosses zu Hause. Mit ihren vielfältigen Exponaten – Haushaltsgegenständen, Textilien, Möbeln, Spielzeug, Uhren, Karten, Waffen, bildender Kunst, historischen Fotografien und vielem mehr – ist sie eine der bedeutendsten kulturgeschichtlichen Sammlungen Thüringens. Die frühesten Funde reichen bis 100.000 Jahre v. Chr. zurück, bis in die Steinzeit. Grabfunde, Werkzeuge, Gefäße, Schmuck und vieles mehr aus der riesigen Sammlung – der zweitgrößten in Thüringen – sind anschaulich präsentiert und zeigen die historische Entwicklung von der Steinzeit bis zur Völkerwanderung auf.

Im Ausstellungsbereich vom Mittelalter bis zum 18. Jahrhundert liegt besonderes Gewicht auf der wirtschaftlichen Entwicklung, der Reformationszeit und den Reformen des ersten Schlossherrn, Ernsts des Frommen, die zu einem Musterstaat führten. Luthers wiederholten Besuchen in Gotha und der anschließenden Erneuerung des Kirchen- und Schulwesens durch seinen Freund Friedrich Myconius wird besondere Aufmerksamkeit gewidmet, aber auch die zahlreichen Anfänge großer Strömungen in Gotha werden aufgezeigt, darunter Astronomie, Freimaurerei und das Schulwesen: Als erster deutscher Fürst führte Ernst I. von Sachsen-Gotha-Altenburg in seinem Herzogtum die Schulpflicht ein.